Sanidad Porcina 08/08

Genes candidatos para la mejora de la respuesta inmune frente a Salmonella

Las nuevas metodologías en genómica y proteómica proporcionan nuevos enfoques para el control genético de enfermedades. La mejora de la inmunidad mediante selección genética requiere del paso previo de la caracterización de genes candidatos.

 

 

El control de las enfermedades que afectan a las especies de interés ganadero es un objetivo que se justifica plenamente hoy día por diferentes motivos: desde el punto de vista económico, la incidencia de la enfermedad supone unos costes considerables que pueden llegar a alcanzar el 10-20% del valor total del coste productivo; por otro lado, se trata de un problema no sólo de sanidad animal, sino que implica a la salud pública directa e indirectamente por la contaminación de los alimentos con el propio agente infeccioso o con los productos usados en el control de la enfermedad; y por último, la salud animal es un reflejo del grado de bienestar, que está directamente relacionado con el nivel de productividad, homogeneidad y calidad de los productos derivados hacia el consumo humano.

Tradicionalmente, los planes de control y lucha contra las enfermedades en

los animales de abasto se han llevado a cabo mediante intervenciones vinculadas a las características del agente patógeno, el hospedador y el medio ambiente en el que se generaron. En la actualidad, los planes de prevención se enfrentan a los nuevos retos que representan enfermedades de difícil erradicación y de posible transmisión al ser humano. Algunas de estas enfermedades son originadas por distintas especies de los géneros Campylobacter, Salmonella y Escherichia coli, responsables de afecciones diarreicas que dan lugar a una mayor tasa de mortalidad y a una menor ganancia de peso.

La salmonelosis es la zoonosis más frecuente en los países europeos, una enfermedad grave que, a veces, puede ser mortal. La bacteria responsable puede transmitirse a través de multitud de alimentos: huevos y derivados, carne de pollo, carne de cerdo, carne bovina, productos lácteos, pescados, mariscos, etc. Se trata de un problema social y económico de gran magnitud. Por ello, el control de esta zoonosis se ha establecido como prioritario por parte de las autoridades sanitarias nacionales e internacionales, con un incremento de la publicación de normas que recogen diferentes medidas de lucha y control de la enfermedad.

Los brotes de salmonelosis en la población humana se han atribuido clásicamente al consumo de productos de origen aviar contaminados con el patógeno, sin embargo, hay que tener en cuenta la importancia de los productos derivados del cerdo. De hecho, en Dinamarca, Holanda y Alemania, entre un 10% y un 23% del total de casos de salmonelosis humana se pueden atribuir al consumo de carne de cerdo y productos derivados.

Los principales problemas que presenta esta zoonosis son su difícil detección por la ausencia de síntomas clínicos patognomónicos, los portadores asintomáticos y la gravedad con la que el proceso afecta a ciertos sectores de la población (ancianos, niños e inmunodeprimidos) pudiendo incluso llegar a producir la muerte.

Enfoque alternativo

 

La etiología de este tipo de procesos es compleja, pues la manifestación clínica

del agente patógeno está asociada a la presencia de múltiples factores de susceptibilidad (Rowland y Lawson, 1992; Segales y Morris, 2003). Pese a las medidas tradicionales de control sanitario, las pérdidas achacables a estas enfermedades infecciosas siguen constituyendo un pesado lastre para la industria agropecuaria.

Una solución alternativa a este problema podría hallarse en la resistencia genética a la enfermedad ligada a mecanismos inmunológicos, esto es, la capacidad inherente de un animal de resistir a la presencia de patógenos en su organismo sin haber tenido contacto previo con ellos.

Aunque los modos de alimentación y cría influyen sobre la variabilidad en la expresión de la enfermedad, ha podido observarse que la resistencia natural es hereditaria y se transmite de un progenitor a su descendencia. Profundizar en el conocimiento de la base genética de la respuesta inmune, tanto innata o natural, como específica o adquirida, permitirá la identificación de genes asociados a fenotipos, genes marcadores que pudieran ser utilizados en programas de selección que permitan aumentar el nivel general de resistencia

a las enfermedades en las poblaciones animales (Stear et al., 2001).

 

La complejidad genética de la inmunidad

 

La regulación de la respuesta inmune a las infecciones bacterianas es un carácter genéticamente complejo, influido por numerosos genes con control sobre los distintos procesos de la interacción entre huésped y patógeno. Así, está considerado que al menos 2.000 genes pudieran estar controlando los procesos de respuesta inmune frente a patógenos (Wilkie y Mallard, 2000) por lo que el aislamiento y caracterización de genes marcadores para este complejo carácter requiere de estrategias que permitan disponer de un repertorio de genes lo más amplio posible con el fin de estimar su valor como genes candidatos (Rothschild, 2003). Un gen candidato es aquel localizado

en una región cromosómica susceptible de estar relacionada con una enfermedad. La caracterización de genes candidatos para la mejora de la respuesta inmune tiene como fin último establecer planes de selección para aumentar la resistencia genética a las enfermedades.

Es necesario para ello tener en cuenta que los mecanismos naturales de la

defensa inmunitaria están controlados a nivel molecular por las proteínas, de tal

manera que los distintos alelos de un gen candidato para la resistencia a la infección pueden determinar la expresión de proteínas con mayor o menor eficacia funcional frente a un determinado agente infeccioso (Adams y Templeton, 1998).

El actual desarrollo de las técnicas de biología molecular permite la identificación y análisis en el laboratorio de mutaciones localizadas en zonas potencialmente funcionales de los genes. Este polimorfismo, originado en cambios de secuencia de un único nucleótido (SNP, del inglés single nucleotide polimorphism) constituye la base de la variabilidad del genotipo y permite la identificación de alelos funcionales susceptibles a la infección que pueden ser eliminados de las poblaciones naturales mediante selección (Houston et al., 2003; Zhou y Lamont, 2003).

Desde que en los años 90 se iniciaran los distintos programas de cartografía

genómica (PigMap en porcino, BovMap en bovino, GoatMap en caprino, etc.), la incorporación de las herramientas e información aportadas por la genómica

ha permitido en los últimos años un rápido desarrollo de los conocimientos

sobre la organización cromosómica y complejidad del genoma de las especies

ganaderas. Así, el mapa genético porcino contiene actualmente más de 2.900

marcadores (incluyendo microsatélites, AFLP y SNP), de los cuales 924 corresponden a genes funcionales. Esta información ha permitido la caracterización de un importante número de QTL(Quantitative Trait Loci, región de ADN asociada con un rasgo fenotípico concreto) relacionados con caracteres de importancia económica, como tasa de crecimiento, calidad de la carne, características de la canal, engrasamiento, etc. (Zhi-Liang et al., 2005). Para los caracteres relacionados con la reproducción y particularmente con la resistencia genética a enfermedades, los resultados de detección de QTL son limitados, a excepción de algunos trabajos de valoración de la capacidad de la respuesta inmune (Edfors-Lilja et al., 1998), o la estimación de la relación entre el sistema inmunitario y el estrés (Milan, 1998).

Sin embargo, ha sido descrita la existencia de un gen responsable de la resistencia a la diarrea posterior al destete causadapor la estirpe bacteriana E. coli F18 (Meijerink et al., 2000) y es conocida la implicación del complejo de histocompatibilidad porcino (SLA) en la resistencia a la infección con Trichinella spiralis (Madden et al., 1993).

 

Ayuda de los genes ya conocidos

 

La información disponible sobre genes previamente aislados (información que

puede proceder de otros proyectos genoma o de las bases de datos de

EST/cDNA) resulta de gran utilidad en la búsqueda de genes candidatos para la mejora de la respuesta inmune. En este caso se aplica el principio de que un gen con un efecto sobre un carácter en una especie puede ser considerado como candidato para el mismo o similar carácter en otra especie. Así, el gen NRAMP1 fue asociado con resistencia a Salmonella en ratón (Caron et al., 2002) y su implicación en la infección generada por este patógeno en cerdos está siendo evaluada actualmente por algunos grupos de investigación (van Diemen et al., 2002; Wigley, 2004).

Finalmente, una vez seleccionados los genes candidatos mediante las propuestas anteriores, se emplean para determinar la existencia de factores genéticos relacionados con el desarrollo de la enfermedad asociada a la infección por Salmonella. El conocimiento actual sobre la base genética de la resistencia a patógenos en estas especies es casi inexistente. Esta falta de información puede ser superada mediante el empleo de nuevas técnicas como los microarrays y la proteómica, cuyos buenos resultados obtenidos tras su uso en humana abren un gran campo de aplicación en producción animal.

 

Metodología en la búsqueda de genes candidatos

 

Mediante aproximaciones de genómica funcional, se plantea la utilización de

microarrays y técnicas de proteómica para la identificación de nuevos genes

candidatos y estudiar así la base genética de la resistencia a enfermedades infecciosas como la salmonelosis.

Microarrays

Existen distintos tipos de ensayos biológicos englobados dentro del término

microarrays: de ADN, de proteínas y de tejidos, entre otros. En esta ocasión nos centraremos en el microarray de ADN.

Un microarray de ADN (de aquí en adelante microarray) es un soporte sólido de pequeño tamaño que tiene inmovilizadas en localizaciones fijas las secuencias de miles de genes diferentes. El soporte en sí normalmente es una lámina de cristal, aunque también pueden ser de silicona o nailon.

Sobre este soporte el ADN se imprime, se puntea o se sintetiza directamente.

Los microarrays suponen un gran avance científico ya que pueden contener un

gran número de genes en un espacio muy reducido. Son de gran utilidad cuando se quiere estudiar un gran número de genes de manera rápida o cuando la muestra a estudiar es pequeña. Los microarrays se pueden usar para analizar la expresión en una muestra simple o para comparar la expresión génica en dos tipos celulares o muestras de tejidos distintas, como es el

caso de tejidos sanos y enfermos. Esta tecnología se encuentra aún en sus etapas iniciales, aunque los resultados obtenidos hasta ahora la presentan como una herramienta de gran utilidad para el mejor conocimiento del genoma.

El fundamento del uso del microarray (ver figura en página anterior) está basado en un proceso de hibridación, una técnica que usa moléculas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia como “sondas móviles” que identifican las moléculas complementarias. Así, la cadena complementaria de G-T-C-A-T-T sería C-AG- T-A-A. Cuando dos secuencias complementarias se encuentran, como en el caso del ADN inmovilizado en el microarray y la sonda móvil de ADN, ADNc o ARNm, se unen, es decir, se hibridan.

En un caso práctico, se consideran dos tejidos, uno sano (S) y otro enfermo (E). Ambos contienen un conjunto idéntico de tres genes: 1, 2 y 3. El objeto del empleo del microarray sería el estudio de la expresión de los tres genes en los dos tejidos. Para ello, se aísla el ARNm de cada uno de los tejidos y se usa como molde para generar ADNc unido a un marcador fluorescente. Se usan marcadores diferentes (rojo y verde) para los distintos tejidos para poder continuar identificándolos en las siguientes etapas del proceso. Los dos ADNc marcados se incuban con el microarray que contiene inmovilizados los genes 1, 2 y 3. Las  moléculas marcadas se unen a los sitios del microarray correspondientes a los genes expresados en cada tejido. Una vez finalizado el proceso de hibridación, el microarray se coloca en un escáner que contiene un láser, un microscopio especial y una cámara. El láser excita los marcadores

fluorescentes y el microscopio y la cámara crean una imagen digital del microarray. Estos datos son posteriormente analizados con el programa adecuado que genera una tabla que contiene los ratios de intensidad de la fluorescencia verde/roja de cada punto del microarray.

Así, el programa puede concluir, por ejemplo, que los dos tejidos expresan el

gen 1 al mismo nivel, que el tejido E expresa más el gen 2 que el tejido S, y que ninguno de los tejidos expresan el gen 3. Una vez caracterizado el patrón de expresión de varios genes implicados en una enfermedad, el material de un individuo se puede hibridar para determinar si el patrón de expresión obtenido coincide con el de una enfermedad conocida. En ese caso, se podrá iniciar el tratamiento adecuado para cada proceso. También se puede estudiar la evolución de una enfermedad concreta.

Así mismo, los microarrays se pueden usar para el desarrollo de nuevos medicamentos. Por ejemplo, si un gen está sobreexpresado en un tipo de cáncer, se puede comprobar si un nuevo medicamento reduce la sobreexpresión y provoca la remisión del proceso.

 

Proteómica

 

La proteómica es la ciencia que correlaciona las proteínas con sus genes, estudia el conjunto completo de proteínas que se pueden obtener de un genoma. También es posible entender la proteómica como el conjunto de técnicas que permiten analizar el conjunto de proteínas presentes

en la célula en determinado momento, es decir, el proteoma.

Estas técnicas incluyen la 2D-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida

de dos dimensiones) y la MS (espectrometría de masas). La 2D-PAGE es el

principal método de separación, siendo posible aislar completamente hasta

10.000 proteínas. Dicha separación se lleva a cabo en función del punto isoeléctrico y el peso molecular de cada proteína. La MS es esencial en proteómica debido a su alta capacidad de análisis, su sensibilidad y su precisión en la determinación de pesos moleculares proteicos, así como por la información sobre la composición molecular que se deriva del peso molecular. La manera más fácil de hacer un estudio proteómico es comparar los proteomas de dos condiciones por ejemplo, células o tejido de un animal

sano frente a las de un animal enfermo) y observar sus diferencias.

La proteómica nos permitirá conocer el sitio de expresión de las proteínas, sus

interacciones y modificaciones postraduccionales. Puesto que muchas de las

funciones celulares están relacionadas con estas propiedades, la aproximación

proteómica es necesaria como complemento de cualquier estudio genómico

(Angenieux et al., 2001).

 

Marcadores genéticos

 

Microsatélites

Son fragmentos en el DNA nuclear, generalmente en zonas no codificantes y

codominantes, que consisten en repeticiones de motivos de 1 a 6 nucleótidos

que se ubican uno tras otro. Un ejemplo de la secuencia de un microsatélite

sería el tándem AG repetido nueve veces. Se utilizan como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la genética,

como parentescos y estudios de poblaciones.

 

Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados (AFLP)

Son fragmentos de ADN obtenidos por PCR tras la digestión del ADN genómico por enzimas de restricción. La técnica utilizada fue desarrollada por Vos et al. (1995). El polimorfismo se detecta por la presencia o ausencia de fragmentos y son normalmente de herencia dominante.

 

Polimorfismo de un solo nucleótido o SNP

Es una variación en la secuencia de ADN que afecta a un solo nucleótido del genoma. Sin embargo, algunos autores consideran que cambios de unos pocos

nucleótidos, como también pequeñas inserciones y deleciones pueden ser consideradas como SNP, donde el término polimorfismo de nucleótido simple

es más adecuado. Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la población para ser considerada como un SNP.

 

Cristina Arce Jiménez, Ángeles Jiménez Marín y Juan José Garrido Pavón

Dpto. Genética. Fac. Veterinaria. Universidad de Córdoba. España.

 

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